Производные жиров и масел
– Метиловые эфиры жирных кислот
– Определение свободного и общего содержания глицерина, а также моно-, ди-, триглицерида (эталонный метод)

ЕВРОПЕЙСКИЙ СТАНДАРТ EN 14105

Апрель 2003 г.

_____________________________________________________________________________________
ICS 67.200.10

Производные жиров и масел
– Метиловые эфиры жирных кислот
– Определение свободного и общего содержания глицерина, а также моно-, ди-, триглицерида (эталонный метод)

Настоящий Европейский стандарт утвержден Европейским комитетом по стандартизации (CEN) 2 января 2003 г.

Члены Европейского комитета по стандартизации обязаны соблюдать внутренние нормы Европейского комитета по стандартизации и Европейского комитета по электротехническим стандартам (CEN/CENELEC), определяющие условия присвоения настоящему Европейскому стандарту статуса национального стандарта без внесения в него каких-либо изменений. Перечни, отражающие существующее состояние, а также библиографические ссылки, относящиеся к таким национальным стандартам, можно получить, подав соответствующую заявку в Центр управления, либо любому члену Европейского комитета по стандартизации.

Настоящий Европейский стандарт существует в трех официальных вариантах (варианты на английском, французском и немецком языке). Вариант на любой другом языке, являющемся языком одного из членов Европейского комитета по стандартизации, который несет ответственность за выполнение перевода стандарта на этот язык, а также вариант, о подготовке которого поставлен в известность Центр управления, имеет такой же статус, что и официальные варианты.

Члены Европейского комитета по стандартизации представлены органами национальной стандартизации Австрии, Бельгии, Республики Чехия, Дании, Финляндии, Франции, Германии, Греции, Венгрии, Исландии, Ирландии, Италии, Люксембурга, Мальты, Нидерландов, Норвегии, Португалии, Словакии, Испании, Швеции, Швейцарии и Великобритании.

_____________________________________________________________________________________

Вступление

Настоящий документ (EN 14105:2003) был подготовлен Техническим комитетом CEN/TC (Европейский комитет по стандартизации/Технический комитет) 307 «Семена масличных культур, растительные и животные жиры и масла, а также их субпродукты – Методы взятия образцов и методы анализа», секретариат которого организован Французской ассоциацией по стандартизации.

Настоящему Европейскому стандарту должен быть присвоен статус национального стандарта, либо путем опубликования идентичного текста, либо путем подтверждения, не позднее октября 2003 г. Все национальные стандарты, содержащие противоречия, должны быть изъяты из обращения не позднее октября 2003 г.

Настоящий документ подготовлен на основании поручения М/245 «Метиловые эфиры жирных кислот», возложенного на Европейский комитет по стандартизации Европейской комиссией и Европейской ассоциацией свободной торговли.

Приложения А - Г являются информативными.

Согласно внутренним нормам Европейского комитета по стандартизации и Европейского комитета по электротехническим стандартам (CEN/CENELEC), организации по национальной стандартизации следующих стран обязаны применить настоящий Европейский стандарт: Австрия, Бельгия, Республика Чехии, Дания, Финляндия, Франция, Германия, Греция, Венгрия, Исландия, Ирландия, Италия, Люксембург, Мальта, Нидерланды, Норвегия, Португалия, Словакия, Испания, Швеция, Швейцария и Великобритания.

1. Объем

Настоящий Европейский стандарт устанавливает метод определения свободного содержания глицерина и остаточного моно-, ди- и триглицерида в метиловых эфирах жирных кислот, предназначенных для добавления в минеральные масла. После этого, на основании полученных результатов, определяют общее содержание глицерина.

Данный метод применим к метиловым эфирам жирных кислот, получаемым из рапсового, подсолнечного, соевого масла, но не применим к метиловым эфирам жирных кислот, получаемым из кокосового и косточкового пальмового масла, либо содержащим его, из-за перекрывания пиков.

ВНИМАНИЕ! Применение данного метода может предусматривать использование опасных оборудования, материалов или операций. Мы не претендуем на то, что в отношении к данному методу учтены все вопросы, касающиеся его безопасного применения, и обязываем лиц, применяющих данный метод, определить и установить надлежащие меры безопасности, а также определить применимость нормативных ограничений перед началом применения данного метода.

2. Принципы

Преобразование глицерина и моно- и диглицеридов в более летучие силилированные производные в присутствии пиридина и N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамида (МСТФА).

Анализ силилированных производных методом газовой хроматографии на короткой капиллярной колонке с малой толщиной пленки, с применением инжектора или аналогичного устройства и пламенно-ионизационного детектора.

После выполнения калибровки производится количественная оценка в присутствии двух внутренних эталонов:

• 1,2,4-бутантриол, применяемый для определения свободного содержания глицерина;
• 1,2,3-трикапроилглицерин (трикаприн), применяемый для определения глицеридов (моно, ди- и три-).

3. Реактивы

Использовать только реактивы, имеющие признанную аналитическую чистоту, если не имеется других указаний.

3.1 N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамид (МСТФА)

3.2 Пиридин, хранимый на молекулярном сите

3.3 n-гептан

3.4 1,2,4-бутантриол (внутренний этанол № 1)

3.5 1,2,3-трикапроилглицерин (трикаприн) (внутренний эталон № 2)

3.6 Эталонные вещества : глицерин, 1-моноолеоилглицерин (моноолеин), 1,3-диолеоилглицерин (диолеин), 1,2,3-триолеоилглицерин (триолеин), чистый – стандартная чистота газожидкостной хроматографии

3.7 Концентрированный раствор внутреннего эталона № 1,, 1мг/мл

Точно взвесить около 50 мг (с точностью до 0,1 мг) 1,2,4-бутантриола (3.4) в мерной колбе емкостью 50 мл (4.4) и довести до отметки пиридином (3.2).

3.8 Концентрированный раствор внутреннего эталона № 2, 8мг/мл

Точно взвесить около 80 мг (с точностью до 0,1 мг) 1,2,3-трикапроилглицерина (3.5) в мерной колбе емкостью 10 мл (4.5) и довести до отметки пиридином (3.2).

3.9 Концентрированный раствор глицерина, 0,5 мг/мл

Точно взвесить около 50 мг (с точностью до 0,1 мг) глицерина (3.6) в мерной колбе емкостью 10 мл (4.5) и довести до отметки пиридином (3.2). При помощи пипетки (4.7) перенести 1 мл данного раствора в мерную колбу емкостью 10 мл (4.5) и довести до отметки пиридином (3.2).

3.10 Концентрированный раствор глицерида, 5 мг/мл

Применительно к каждому эталонному глицериду, моно-, ди- и триолеину (3.6) точно взвесить около 50 мг (с точностью до 0,1 мг) в мерной колбе емкостью 10 мл (4.5) и довести до отметки пиридином (3.2).

3.11 Моноглицериды¹⁾, промышленная смесь

Включает монопальмитоилглицерин (монопальмитин), моностеароилглицерин (моностеарин) и моноолеоилглицерин (моноолеин), присутствующие в количествах, имеющих одинаковую массу.

Приготовить концентрированный раствор данной смеси, взвесив около 100 мг в мерной колбе емкостью 10 мл (4.5) и доведя до отметки пиридином (3.2).

3.12 Ежедневно приготавливать четыре калибровочных раствора, перенося в серию пробирок (4.6) объемы концентрированных растворов эталонных веществ (3.9 и 3.10) и внутренних эталонов (3.7 и 3.8), приведенных в Таблице 1, при помощи микрошприцов (4.8 и 4.9). Выбор соответствующего шприца необходимо произвести согласно Таблице 1. Не использовать объем шприца полностью сразу, а разделить его на две части (например, при дозе 100мкл, содержащейся в шприце емкостью 100 мкл, ввести раствор за два раза – по 50 мкл). Убедиться в том, что в игле и внутри корпуса шприца не имеется пузырьков воздуха. Замерять объемы только по величине разницы между ними (то есть, при введении 80 мкл наполнить шприц до отметки 100 мкл и ввести раствор до отметки 20 мкл).

ЗАМЕЧАНИЕ. Силилированные титрованные растворы сохраняют устойчивость только в течение одного дня.

Таблица 1. Приготовление калибровочных растворов

3.14 Вспомогательные газы:

• воздух;

• водород.

4. Оборудование

Стандартное лабораторное оборудование, включая, в частности, следующее:

4.1 Газовый хроматограф, оснащенный инжектором колонки или аналогичным устройством, печью с программируемой температурой и пламенно-ионизационным детектором.

4.2 Капиллярная колонка, которая может быть запрограммирована на значение до 400 оС («высокотемпературный» тип) и для которой рекомендуется применение следующих характеристик:

• 100 % диметилполисилоксан или 95 % диметил-5 % неподвижная фаза дифенилполиксилоксана;

• длина – 10 м;

• внутренний диаметр – 0,32 мм;

• толщина пленки – 0,1 мкм.

4.3 Рабочие условия

Условия хроматографического анализа будут выбраны с учетом характеристик применяемой колонки и типа газа-носителя (водород или гелий). Тем не менее, мы рекомендуем соблюдать время анализа, равное 30 минутам, c целью обеспечения элюирования триглицеридов.

Ниже продемонстрирован пример условий проведения анализа:

4.4 Мерная колба, емкость – 50 мл.

4.5 Мерные колбы, емкость – 10 мл.

4.6 Колпачковые пробирки с мембранами, имеющими политетрафторэтиленовое покрытие, емкость – 10 мл.

4.7 Прецизионная пипетка, емкость – 1 мл.

4.8 Микрошприц, емкость – 100 мкл.

4.9 Микрошприц, емкость – 500 мкл.

4.10 Микрошприц, емкость – 1 мкл, специально предназначен для работы на колонке

4.11 Градуированный цилиндр, емкость – 10 мл.

4.12 Аналитические весы, точность - + 0,1 мг.

5. Порядок выполнения работы

5.1 Приготовление и анализ калибровочных растворов

При помощи микрошприца (4.8) добавить 100 мкл N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамида (МСТФА) (3.1) в каждый из четырех калибровочных растворов (3.12), герметично закрыть и энергично взболтать пробирки, избегая каких-либо контактов с влагой. Хранить 15 минут при комнатной температуре, после чего добавить 8 мл гептана (3.3), используя для этого градуированный цилиндр (4.11).

Выполнить анализ 1 мкл каждой реакционной смеси методом газовой хроматографии в условиях, определенных выше (4.3). Каждая реакционная смесь обусловливает выполнение двух хроматографических анализов. Образцы сохраняют устойчивость в течение нескольких часов после дериватизации (получения производного соединения).

5.2 Приготовление и анализ промышленной смеси моноглицеридов

При помощи микрошприцов (4.8 и 4.9) перенести 200 мкл промышленной смеси моноглицерида, растворенного в пиридине (3.11), и 100 мкл МСТФА (3.1) в пробирку вместимостью 10 мл (4.6). Избегать каких-либо контактов с влагой. Герметично закрыть и энергично взболтать пробирку. Хранить в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего добавить 8 мл гептана (3.3). Выполнить анализ 1 мкл реакционной смеси методом газовой хроматографии согласно условиям, описанным выше (4.3).

5.3 Отбор образцов

Порядок отбора образцов не относится к методу, определенному в настоящем Европейском стандарте. Рекомендуемый метод отбора образцов приведен в стандарте EN ISO 5555 [1].

5.4 Приготовление и анализ образцов

Взвесить около 100 мг гомогенизированного образца в пробирке емкостью 10 мл (4.6). При помощи шприца (4.8 и 4.9) добавить 80 мкл концентрированного раствора внутреннего эталона № 1 (3.7), 100 мкл концентрированного раствора внутреннего эталона № 2 (3.8) и 100 мкл МСТФА (3.1). Избегать каких-либо контактов с влагой. Герметично закрыть и энергично взболтать пробирку. Хранить в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего добавить 8 мл гептана (3.3). Выполнить анализ 1 мкл реакционной смеси методом газовой хроматографии согласно условиям, описанным в (4.3).

В отношении каждого образца две анализируемые порции подвергаются реакции дериватизации, и каждая из них обусловливает выполнение двух хроматографических анализов. Образцы сохраняют устойчивость в течение нескольких часов после дериватизации.

5.5 Идентификация

Анализ калибровочных растворов, выполняемых в одинаковых рабочих условиях, аналогичных условиям выполнения анализа образца, обеспечивает идентификацию пиков за счет сравнения времени удерживания. Учитывая перекрывание зон элюирования метиловых эфиров и моноглицеридов, мы рекомендуем, с целью идентификации пиков моноглицеридов, ввести промышленную смесь, состоящую из монопальмитина, моностеарина и моноолеина (3.11), где последняя составляющая была ранее подвержена реакции дериватизации (5.2).

В Приложении В (Рисунки В.1 – В.4) представлена хроматограмма образца метилового эфира рапсового масла, полученного в рабочих условиях и по методике приготовления, которые описаны выше (4.3 и 5.4). В Таблице 2 указаны относительные значения времени удерживания, соответствующие различным пикам, подлежащим интегрированию.

Таблица 2. Соответствующее время удерживания глицерина и глицеридов

5.6 Калибровка

В отношении каждого эталонного вещества (моноолеин, диолеин и триолеин) анализ изменения весового отношения в зависимости от отношения площади позволяет проверить линейность реагирования и разработать функции калибровки.

6. Выражение результатов

6.1 Интегрирование пиков

Приведенные ниже функции калибровки (6.2 и 6.3) допускаются к применению только в пределах указанных интервалов содержания (Таблица 3).

Таблица 3

В каждом семействе триглицеридов существуют малые пики (см. Приложение Б), которые подлежат интегрированию, а также к которым не могут быть применены функции калибровки, что связано с пределами интервалов их содержания. Поэтому данный метод предусматривает вычисление процентного отношения моно-, ди- и триглицеридов (6.5) путем суммирования площади пиков по каждому семейству, в то время как согласно теории, должно быть вычислено процентное отношение каждого пика глицерида, взятого отдельно.

Мы рекомендуем выполнить совместное интегрирование двух пиков глицерида, содержащих 36 атомов углерода, основные соединения данного семейства, в связи с недостаточным разрешением, что может привести к ошибкам количественного определения в том случае, если пики интегрируются по отдельности. Аналогичная методика интегрирования может быть применена в отношении пиков диглицерида, содержащих 34 атома углеродов, а также в отношении пиков диглицерида, содержащих 38 атомов углерода.

Наличие двойного пика на уровне времени удерживания глицерина должно обусловить проверку стадии силилирования, являющейся, вероятно, неполной (присутствие воды в образцах).

6.2 Функция калибровки глицерина

Функция калибровки представлена следующим выражением, полученным из экспериментальных данных, предусматривающих применение метода линейной регрессии (см. Приложение А для определения данных):

M_g/M_ei1 = a_g (A_g/A_ei1) + b_g ,

где

M_g – масса глицерина (мг);

M_ei1 – масса внутреннего эталона № 1 (мг);

A_g – площадь пика глицерина;

A_ei1 – площадь пика внутреннего эталона № 1;

a_g и b_g – постоянные, полученные за счет применения метода регрессии в отношении глицерина.

Функцию калибровки можно считать приемлемой только в том случае, если коэффициент корреляции, определенный согласно Приложению А, равен значению 0,95 или превышает его.

6.3 Функция калибровки глицеридов

Функции калибровки представлены следующими выражениями, полученными из экспериментальных данных, предусматривающих применение метода линейной регрессии (см. Приложение А для определения данных):

M_m/M_ei2 = a_m (A_m/A_ei2) + b_m

M_d/M_ei2 = a_d (A_d/A_ei2) + b_d

M_t/M_ei2 = a_t (A_t/A_ei2) + b_t ,

где

M_m, M_d, M_t – соответственно масса моноолеина, диолеина и триолеина (миллиграммы);

M_ei2 – масса внутреннего эталона № 2 (миллиграммы);

A_m, A_d, A_t – площади пика соответственно моноолеина, диолеина и триолеина;

A_ei2 – площадь пика внутреннего эталона № 2;

a_m и b_m – постоянные, полученные за счет применения метода регрессии в отношении моноглицерина;

a_d и b_d – постоянные, полученные за счет применения метода регрессии в отношении диглицерина;

a_t и b_t – постоянные, полученные за счет применения метода регрессии в отношении триглицерина.

Функцию калибровки можно считать приемлемой только в том случае, если коэффициент корреляции, определенный согласно Приложению А, равен значению 0,95 или превышает его.

6.4 Вычисление процентного отношения свободного содержания глицерина

Вычислить процентное отношение (м/м) свободного содержания глицерина в образце по следующей формуле:

G = [a_g (A_g/A_ei1) + b_g] x (M_ei1/m) · 100 ,

где

G – процентное отношение (м/м) свободного содержания глицерина в образце;

A_g – площадь пика глицерина;

A_ei1 – площадь пика внутреннего эталона № 1;

M_ei1 – масса внутреннего эталона № 1 (миллиграммы);

m – масса образца (миллиграммы);

a_g и b_g – постоянные, полученные за счет применения метода регрессии в отношении глицерина.

6.5 Вычисление процентного отношения глицеридов

Вычислить процентное отношение (м/м) моно-, ди- и триглицеридов по следующим формулам:

M = [a_m (∑A_mi/A_ei2) + b_m] · (M_ei2/m) · 100

D = [a_d (∑A_di/A_ei2) + b_d] · (M_ei2/m) · 100

T = [a_t (∑A_ti/A_ei2) + b_t] · (M_ei2/m) · 100

где

M, D, T – процентное отношение (м/м) моно-, ди- и триглицерида в образце;

∑A_mi, ∑A_di, ∑A_ti – суммы площадей пиков моно-, ди- и триглицеридов;

A_ei2 – площадь пика внутреннего эталона № 2;

M_ei2 – масса внутреннего эталона № 2 (миллиграммы);

m – масса образца (миллиграммы);

a_m и b_m – постоянные, полученные за счет применения метода регрессии в отношении моноглицерина;

a_d и b_d – постоянные, полученные за счет применения метода регрессии в отношении диглицерина;

a_t и b_t – постоянные, полученные за счет применения метода регрессии в отношении триглицерина.

6.6 Вычисление процентного отношения общего содержания глицерина

Вычислить процентное отношение (м/м) общего содержания глицерина по следующей формуле:

G_T = G + 0,255 M + 0,146 D + 0,103 T ,

где

G_T – процентное отношение (м/м) общего содержания глицерина (свободного и связанного) в образце;

G – процентное отношение (м/м) свободного глицерина в образце;

M – процентное отношение (м/м) моноглицеридов в образце;

D – процентное отношение (м/м) диглицеридов в образце;

T – процентное отношение (м/м) триглицеридов в образце.

6.7 Представление результатов

Все содержания выражены в процентном отношении (м/м) с точностью до 0,01 %.

7. Показатели точности

7.1 Межлабораторные анализы

Межлабораторные анализы, организованные в 1988 г. на Европейском уровне при участии одиннадцати лабораторий, каждая из которых выполнила два расчета по каждому образцу, показали статистические результаты, приведенные в Приложении Г.

7.2 Повторяемость

Абсолютная разница между двумя независимыми результатами одного анализа, полученными при помощи одного и того же метода, с использованием аналогичного материала анализа, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, использующим аналогичное оборудование, в течение малого промежутка времени, не должна превышать более одного раза из 20 расчетов следующие значения:

Таблица 4

7.3 Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя результатами одного анализа, полученными при помощи одного и того же метода, с использованием аналогичного материала анализа, в различных лабораториях, различными операторами, использующими различное оборудование, не должна превышать более одного раза из 20 расчетов следующие значения:

Таблица 5

8. Отчет о результатах анализа

В отчете должна быть представлена следующая информация:

• полный объем информации, необходимый для детальной характеристики образца;
• используемый метод взятия образца, если он известен;
• применяемый метод анализа со ссылкой на данный Европейский стандарт;
• все рабочие подробные данные, не включенные в настоящий Европейский стандарт, либо признанные необязательными, включая подробные данные о любых событиях и обстоятельствах, способных повлиять на результаты анализа;
• полученные результаты анализа, либо, в случае проверке повторяемости, полученный окончательный результат.

Приложение А
(информативное)

Вычисление функции калибровки – метод линейной регрессии

ЗАМЕЧАНИЕ. Принцип вычисления показан на примере глицерина, но при этом другие функции калибровки могут быть вычислены аналогичным образом на основании данных, полученных методом газовой хроматографии. После введения калибровочных растворов необходимо заполнить следующую таблицу:

Таблица А.1

где

M_g – масса глицерина (миллиграммы);

M_is1 – масса IS 1 (миллиграммы);

A_g – площадь пика глицерина;

A_is1 – площадь пика IS 1.

В нашей функции регрессии Х представлен членом A_g/A_is1, в то время как Y представлен членом M_g/M_is1.

3.13 Газ-носитель, водород или гелийЗаполнить вторую таблицу, используя Х и Y, как указано выше:

Таблица А.2

После этого вычислить сумму каждого ряда:

и далее:

( ∑ X)² = ............ ( ∑ Y)² = ............... и N = ..........................(количество замеров)

полученные данные позволяют вычислить:

и

Коэффициент корреляции r может быть определен по следующей формуле:

Приложение Б
(информативное)

Рабочий пример

Таблица Б.1 – Экспериментальные данные

Таблица Б.2

(∑X)² = 14,577 (∑Y)² = 11,710 и N = 8

Приложение В
(информативное)
Хроматограмма образца метилового эфира жирных кислот рапсового масла – Определение моно-, ди-, триглицеридов и свободного глицерина

Обозначения:

Рисунок В.1. Полная хроматограмма образца метилового эфира жирных кислот рапсового масла. Характеристика пиков моно-, ди- и триглицеридов

Рисунок В.2. Моноацилглицериды; Рисунок В.3. Диацилглицериды; Рисунок В.4. Триацилглицериды

Приложение Г
(информативное)

Результаты межлабораторных анализов

Для выполнения Европейского совместного анализа, в котором приняли участие 11 лабораторий из 5 стран, были использованы 5 следующих образцов:

образец 1: метиловые эфиры жирных кислот, полученные из рапсового масла;

образец 2: метиловые эфиры жирных кислот, полученные из подсолнечного масла;

образец 3: метиловые эфиры жирных кислот, полученные из рапсового масла;

образец 4: метиловые эфиры жирных кислот, полученные из рапсового масла;

образец 5: метиловые эфиры жирных кислот, полученные из рапсового масла и подсолнечного масла (25 % - рапсовое семя)

Выполнение анализа было организовано Техническим комитетом Европейского комитета по стандартизации (CENT C 307/WG1) в октябре 1998 г. Полученные результаты были подвергнуты статистическому анализу в соответствии с EN ISO 4259 [2], в результате которого были получены показатели точности, представленные в Таблицах Г1 и Г2.

Таблица Г1. Моноглицериды

Таблица Г2. Диглицериды

Таблица Г3. Триглицериды

Таблица Г4. Свободный глицерин

Таблица Г5. Общий глицерин

Литература